Acides nucléiques comme cibles et médicaments - approches de photomarquage

Activation photochimique de ligands covalents et sélectifs de l'ADN G-quadruplex

Les G-quadruplexes sont des structures non canoniques des acides nucléiques formés au niveau de région riche en guanine et en présence d'ions potassium. Ces structures sont connues pour se former dans le génome humain (> 10 000) et semblent participer à la régulation de phénomènes biologiques.Le but du projet est de développer et étudier des ligands trifonctionnels pour les utiliser comme outils dans un protocole d'immunoprecipitation pour mieux comprendre l'accessibilité et la dynamique des G4s via une association covalente entre le ligand et la structure G4. Les ligands sont composés de i) un coeur PDC qui est capable d'interagir spécifiquement avec les G4s, ii) un groupe photoactivable capable de piéger covalemment les G4s, et iii) un alcyne terminal pour la fonctionnalisation post-piégeage par CuAAC.La première partie présente la synthèse et les études biophysiques et biochimiques des nouvelles familles de ligands G4 photoactivables. La conservation des propriétés du composé PDC vis à vis les G4s a été évalué par des expériences de FRET-melting et G4-FID. Leur capacité a générer une liaison covalente avec la structure G4 a été confirmée par gel d'électrophorèse en condition dénaturante, et les sites d'alkylations ont été identifiés par séquençage chimique et enzymatique.La seconde partie présente les études photochimiques réalisées en présence de prototypes. La nature des espèces réactives a été étudiée par Laser Flash Photolysis. Pour conclure, la photoréactivité a été étudiée en présence de different nucléosides et les adduits produits ont été caracterisés par RMN.

Characterizing G-quadruplex formation : development and integration of novel assays

Les séquences d'acides nucléiques riches en guanines peuvent adopter des structures secondaires non canoniques nommées G-quadruplexes (G4s). Ces structures ont été identifiées dans différents génomes et participent à de nombreux processus physiologiques. De nombreuses séquences G4s putatives (PQS) ont été identifiées par des analyses bioinformatiques et séquençage par immuno-précipitation de la chromatine (ChIP-seq). Par contre, trouver une séquence relativement riche en guanine ne signifie pas forcément qu'elle forme une structure G4. Le but de cette thèse se concentre sur le développement de nouvelles méthodes d'étude in vitro pour la caractérisation de G4s à haut débit, et la validation d'un grand nombre de PQS.Le transfert d'énergie par résonance de type Föster (FRET) est un puissant outil pour le suivi de la dénaturation d'un G4 intramoléculaire fonctionalisé aux extrémités avec deux sondes: un chromophore donneur (FAM) et un accepteur (TAMRA). À faible température, les deux extrémités sont à proximité, permettant la désactivation de la fluorescence du donneur par FRET. Quand la température augmente, le G4 est dénaturé et les deux extrémités s'éloignent, ce qui restaure graduellement la fluorescence du donneur. La température de dénaturation (Tm) peut être obtenue à partir de la courbe de FRET-melting. Une nouvelle méthodologie nommée FRET-melting compétitive (FRET-MC) a été développée, permettant de suivre 48 échantillons en duplica en 2 heures. Le FRET-MC se base sur la compétition d'un ligand sélectif pour les G4s (PhenDC3) entre un G4 reporteur (FAM-Tel21-TAMRA, F21T) et un compétiteur en large excès dont la structure est inconnue. L'interaction du PhenDC3 avec le G4 formé par F21T induit une stabilisation mesurée par l'augmentation du Tm d'environ 23°C. L'excès de compétiteur G4 va piéger le PhenDC3, ramenant le Tm de F21T à la valeur obtenue sans ligand. Une séquence compétitrice qui ne forme pas une structure G4 n'aura pas d'impact sur l'interaction du PhenDC3 avec F21T. Le FRET-MC est une méthode tolérant une grande variabilité de compétiteurs, excepté ceux présentant une faible stabilité thermique, qui se retrouvent sous forme monocaténaire à la température où F21T commence à se dénaturer. Le FRET isotherme (isso-FRET) a été développé comme une alternative compatible avec des G4s peu stables thermiquement. L'iso-FRET exploite deux RNAs : le 37Q (37-quencher) formant un G4 lorsque stabilisé par le PhenDC3, et le F22 (FAM-22) partiellement complémentaire à 37Q. À ce système est ajouté une séquence compétitrice non marquée. Si le compétiteur ne forme pas de G4, le PhenDC3 stabilise 37Q, empêchant son interaction avec F22, ce qui permet un fort signal de fluorescence de F22. Au contraire, un excès de compétiteur formant un G4 piégera le PhenDC3 qui ne sera plus disponible pour stabiliser 37Q. Il en résulte l'hybridation de 37Q avec F22, provoquant la désactivation de la fluorescence de F22. L'iso-FRET peut être utilisé à température 25°C ou physiologique (37°C), ce qui le rend compatible avec les compétiteurs G4s possédants une faible stabilité thermique. En parallèle, la conformation des séquences riches en CG formant des G4s a été réalisée. La structure des séquences riches en GC est étroitement liée au nombre de cytosines, mais également au ratio de [K⁺] / [Na⁺] présent dans le tampon. Les résultats spectroscopiques montrent que CEB25 tolère des boucles continues de cytosines dans un tampon mixte potassium / sodium. Cela implique que les séquences G4s riches en cytosine peuvent toujours adopter une structure G4 dans l'environnement intracellulaire. Les résultats d'UV-melting mettent en évidence que la présence de cytosines dans les boucles G4 ne diminuent pas leur stabilité, mais augmente la probabilité de former une tige-boucle ou un ADN palindromique bicaténaire en compétition. L'emplacement des PQS riches en cytosines a été étudié par analyse bioinformatique et indique une localisation au niveau des pré-ARNm.

Nouveaux ligands fonctionnels des G-quadruplexes pour l’imagerie cellulaire et la capture covalente d’ADN génomique

Les G-quadruplexes (G4s) sont des structures secondaires non canoniques, pouvant être adoptées par des brins d’ADN ou d’ARN riches en guanines possédant au moins quatre répétitions de deux guanines. Ces structures sont aujourd’hui connues pour participer à la régulation de phénomènes biologiques comme la réplication, la transcription et la traduction. Depuis la découverte de ces structures, de nombreuses petites molécules (appelées ligands G4) ont été développées dans le but d’interagir sélectivement avec les G-quadruplexes. Cependant, le caractère très dynamique de ces structures en fait des cibles difficiles à étudier en conditions cellulaires. Il est donc nécessaire de développer des outils moléculaires permettant leur étude en cellules vivantes. Dans ce contexte, une nouvelle méthodologie, appelée G4-GIS a été développée. Cette méthodologie permet de suivre avec précision la localisation de petites molécules in cellulo et combine les avantages de l’utilisation de ligands avec l’immunofluorescence. Pour le développement de ce projet, plusieurs dérivés du ligand des G-quadruplexes PDC ont été fonctionnalisés avec un haptène (5-BrdU), pouvant être reconnu par un anticorps spécifique. La synthèse de ces dérivés implique tout d’abord la fonctionnalisation du PDC par un groupement azoture ou alcyne (PDC-Alk/N3). En parallèle, l’haptène commercial 5-BrdU a été fonctionnalisé par les mêmes groupements azoture ou alcyne (5-BrdU-Alk/N3). Les différents ligands PDC ont ensuite été couplés aux partenaires 5-BrdU-Alk/N3 adaptés par une réaction de CuAAC pour former les composés PDC-BrdU. Cette réaction peu, de plus, être réalisée in cellulo (fonctionnalisation in situ) dans le but d’éviter une potentielle perte d’affinité ou de sélectivité des ligands par la présence de la 5-BrdU. Les différents ligands avant et après fonctionnalisation ont ensuite été testés pour leur capacité à interagir avec les structures G-quadruplexes par deux méthodes biophysiques. L’imagerie cellulaire des ligands PDC-BrdU a ensuite été réalisée par immunofluorescence. De plus, l’immunodétection a pu être réalisée après fonctionnalisation in situ des ligands PDC-Alk/N3 avec la 5-BrdU. Cette méthodologie d’immunodétection de ligands des G-quadruplexes permet ainsi de détecter avec une excellente résolution la localisation de ligands des G-quadruplexes in cellulo. Déterminer la localisation exacte de formation de structures G-quadruplexes à travers le génome représente un réel défi et un enjeu majeur pour la compréhension des rôles biologiques des G-quadruplexes. Pour cela, une nouvelle méthode combinant le marquage par photoaffinité de G4s (PAL) avec l’immunoprécipitation a été développée. Des dérivés du ligand PDC fonctionnalisés à la fois par un groupement photoactivable et une fonction alcyne ont été synthétisés. L’affinité et la sélectivité de ces ligands pour les structures G-quadruplexes ont été évaluées par deux méthodes biophysiques sur différentes séquences G4s. Par ailleurs, la capacité des ligands à générer de façon sélective des liens covalents avec l’ADN G-quadruplex après photo-irradiation a été étudiée. Par la suite, ces molécules seront utilisées en cellules dans le but de réaliser l’immunoprécipitation de fragments d’ADN liés aux ligands après fonctionnalisation in situ avec la 5-BrdU par une réaction de CuAAC. Cette approche permettra de comprendre quelles séquences du génome forment des G4s ainsi que leur accessibilité par des ligands. Cette méthodologie permettra ainsi de clarifier les rôles biologiques associés à la formation de ces structures secondaires.