Transport intracellulaire : ingénierie et mécanismes

            Nous utilisons la technique RUSH qui permet de synchroniser le transport des cargaisons du réticulum endoplasmique (RE) vers la membrane plasmique (Boncompain et al, 2012). Nous avons révélé que, de manière inattendue, les microtubules ne sont pas nécessaires pour l'exportation du Golgi mais pour permettre une maturation fonctionnelle rapide de l'appareil de Golgi (Fourrière et al, 2020). Nous avons également montré que l'exocytose se produit sur des points chauds restreints de la membrane plasmique de manière dépendante des microtubules et de RAB6 (Fourrière, Kasri et al, 2019).
            Nous avons adapté la technique RUSH au High Content Screening pour cribler des bibliothèques complexes de petites molécules. Nous avons identifié une petite molécule inhibant l'activation de d'ARF1 et l'exportation vers le RE (Boncompain et al, 2019a). Nous avons également réalisé un criblage différentiel et identifié des petites molécules qui réduisent le transport du co-récepteur du VIH, le GPCR CCR5, vers la surface cellulaire. Nous avons ensuite montré que ces molécules permettent de réduire l'infection par le VIH des macrophages humains primaires (Boncompain et al, 2019b).
           Nous étudions actuellement s'il existe un lien entre la topologie du RE et l'exportation de protéines. Pour cela, nous développons des approches de suivi de molécules uniques liées à la technique RUSH. L’exportation de protéines depuis le RE étant un événement très rapide, nous mettons également en œuvre des moyens rapides d'inactiver la fonction des protéines dans les cellules, y compris des systèmes basés sur l’auxine et d’autres systèmes basés sur PROTAC. Nous analysons également la manière dont la translocation dans le RE influence les étapes de transport ultérieures.
          La façon dont l’organisation de l’appareil de Golgi et la sécrétion de protéines s’adaptent pour répondre à des besoins spécifiques de sécrétion est encore mal comprise. Nous utilisons des cellules souches pluripotentes induites (iPS) humaines et induisons leur différenciation dirigée en trois types cellulaires différents (chondrocytes, cardiomyocytes et hépatocytes), qui présentent des besoins de sécrétion distincts.
          L'activité de l'appareil de Golgi dans les processus de transport peut être modulée en appliquant des forces internes et externes, suggérant qu'il se comporte comme un organite mécano-sensible (Guet et al, 2014 ; Romani et al, 2019 ; Thèse de doctorat Matthieu Samuel, 2020). Nous étudions les fondements de cette mécano-sensibilité dans les cultures 2D et 3D. Ces travaux bénéficient du développement de nouvelles sondes fluorescentes (« Halo-Flippers ») pour mesurer directement la tension des membranes de Golgi.

               Il est maintenant bien établi que RAB6 régule diverses voies de transport au niveau de l'appareil de Golgi (Goud et al, 2018). La plupart des études sur la fonction de RAB6 ont été réalisées in vitro dans des cellules en culture. Pour étudier sa fonction in vivo, nous avons investi depuis plusieurs années dans la génération de souris RAB6 k/o conditionnelles (système Cre-Lox)(Bardin et al, Biol Cell 2015). L'inactivation constitutive du gène RAB6A (et donc la déplétion des deux isorfomes ubiquitaires RAB6A et RAB6A') est létale au stade embryonnaire (5,5 jours post-coïtum). Pour obtenir une invalidation constitutive ou indicible de RAB6A dans des lignées cellulaires et des tissus spécifiques, la souche RAB6A "floxée" a été croisée avec des souches de souris exprimant le gène de la recombinase Cre sous le contrôle de plusieurs promoteurs Cre spécifiques (Bardin et Goud, 2021).

                La déplétion de RAB6A/A' a été étudiée dans les cellules luminaires de la glande mammaire (Cayre et al, 2020), dans les cellules T CD4 (Carpier et al, 2018) et dans la lignée des mélanocytes (Patwardhan et al, 2017). Dans les cellules neuronales, la déplétion de RAB6A/A' n'entraîne pas de phénotype détectable, mais la double inactivation de RAB6A/A' et de l'isoforme neuronal RAB6B entraîne une microcéphalie prononcée. Ce phénotype peut être expliqué par le rôle de RAB6 dans le transport axonal des protéines de polarité apicale vers le pôle apical des cellules souches neurales (Brault et al, 2022). Nous étudions actuellement le rôle de RAB6 dans l'homéostasie intestinale en déplaçant les trois isoformes dans les cellules épithéliales intestinales.

                  Les souris RAB6 KO sont également utilisées pour étudier si la GTPase RAB6 pourrait réguler une voie sécrétoire pro-tumorogène dans le cancer du sein. Pour ce projet, les souris que nous avons générés pour étudier la fonction de RAB6 dans la glande mammaire sont croisées avec un modèle de souris qui développe dans les 5 à 6 mois des tumeurs mammaires triple-négatives. Nous étudions actuellement si la déplétion de RAB6 retarde ou entrave la formation de tumeurs. 

      Nous avons continué à développer l'approche des anticorps recombinants que nous avons initiée il y a plusieurs années. Nous avons notamment créé nos propres bibliothèques basées sur des échafaudages de nanobodies brevetés (anticorps à domaine unique) et les avons utilisées à la fois pour des études de biologie cellulaire et pour poursuivre des objectifs liés au cancer. Nous avons développé davantage notre approche des anticorps recombinants et sélectionné des nanobodies spécifiques de la conformation pour étudier la dynamine et l'endocytose (Galli et al, 2017). Nous avons également sélectionné des anti-ADN qui peuvent être utilisés pour cibler les tissus avec des origamis d'ADN in vivo (Chakraborty et al, 2021). Parallèlement, nous avons appliqué notre approche à des questions liées au cancer et sélectionné des nanobodies contre des antigènes de surface cellulaire (Alijaj et al, 2020 ; Crepin et al, 2017a, 2017b ; Moutel et al, 2020).

       Nous développons actuellement des tests de criblage fonctionnel permettant l'identification de nanobodies pouvant être utilisés pour un criblage cellulaire spécifique. Nous utiliserons ces approches pour identifier des nanobodies qui peuvent être utilisés pour armer des cellules CAR-T, pour délivrer des charges toxiques à des cellules tumorales ou pour marquer des cellules tumorales in vivo. Cette partie du projet est sous la supervision de Sandrine Moutel au sein de la plateforme d'anticorps liée à l'équipe (https://curie.fr/plateforme/curiecoretech-anticorps-recombinants). 

En plus de l'utilisation des nanobodies pour développer de nouvelles approches diagnostiques et des traitements innovants, nous utilisons également nos connaissances sur le contrôle du trafic intracellulaire pour des applications translationnelles. Par exemple, la technique RUSH peut être adaptée au High Content Screening et nous avons commencé à l'utiliser pour développer des projets translationnels liés aux cellules CAR-T. Nous visons à identifier des molécules capables de bloquer le transport de facteurs thérapeutiques importants tels que le TNF, l'IL6 et PDL1, comme nous l'avons fait précédemment pour le CCR5 (Boncompain et al, 2019b). Nous avons également commencé à mettre en œuvre l'utilisation du protocol RUSH pour contrôler la libération de protéines fonctionnelles in vivo en collaboration avec les équipes de G. Kroemer (Faculté des Cordeliers)(Liu et al, 2020). Nous l'avons également utilisé pour contrôler le transport et ajuster l'activité des protéines CAR dans les cellules T. Nous poursuivrons ce développement en améliorant le contrôle, en exploitant les cellules souches et en apportant le système à l'animal. Nous irons au-delà des cellules CAR-T et utiliserons des expériences in vivo pour contrôler la circuiterie dans l'animal.